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植物熒光活體成像技術(shù)及其應(yīng)用
發(fā)布時間： 2021-06-28 點(diǎn)擊次數(shù)： 5164次植物活體成像技術(shù)能夠在不破壞植物組織的前提下，利用一套非常靈敏的光學(xué)檢測儀器，直接監(jiān)控活體植物的細(xì)胞活動、光合作用和基因行為。其中應(yīng)用*泛的熒光活體成像技術(shù)，由于操作簡單、結(jié)果直觀、靈敏度高等特點(diǎn)，在植物光合機(jī)理、突變體篩選、抗逆基因與表型、生理節(jié)律與發(fā)育等研究中都有大量的應(yīng)用。
熒光活體成像技術(shù)又可以分為兩大類：
一是穩(wěn)態(tài)熒光成像，主要針對GFP等熒光蛋白和DAPI等熒光染料
二是瞬態(tài)熒光成像，代表技術(shù)為脈沖調(diào)制式（Pulse Amplitude Modulated，PAM）葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)，主要用于葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)曲線的成像測量，反映植物光合能力、光系統(tǒng)狀態(tài)、電子傳遞鏈運(yùn)行狀況等。
需要注意的是，一般的穩(wěn)態(tài)熒光成像技術(shù)也可以測量葉綠素?zé)晒猓荒軠y量穩(wěn)定狀態(tài)下的葉綠素?zé)晒狻６~綠素?zé)晒獾膭討B(tài)變化是與光合電子傳遞狀態(tài)密切相關(guān)的，只有脈沖調(diào)制式葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)才能進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)曲線測量，進(jìn)而獲取大量與植物光合機(jī)理相關(guān)的參數(shù)與成像圖。目前國際上僅有FluorCam熒光成像技術(shù)將穩(wěn)態(tài)熒光成像技術(shù)與脈沖調(diào)制式葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)融于一體，是真正功能全面的植物熒光活體成像技術(shù)，能夠在一臺儀器上實(shí)現(xiàn)GFP、BFP、CFP、YFP、RFP等熒光蛋白成像、DAPI等熒光染料成像、脈沖調(diào)制式葉綠素?zé)晒獬上褚约?/span>NDVI反射光譜成像分析功能。同時，除了植物樣品外，FluorCam熒光成像技術(shù)也可以進(jìn)行藻類、珊瑚共生體、菌落乃至動物的熒光成像分析。
文獻(xiàn)案例一：抗病毒基因研究
法國國家農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院（INRA）的Jean-Luc Gallois研究團(tuán)隊(duì)一直致力于馬鈴薯y病毒組的抗病基因研究。這一病毒組中包括蕪菁花葉病毒(TuMV)、西瓜花葉病毒(WMV)、三葉草黃脈病毒(ClYVV)等重要的農(nóng)作物病毒。這方面研究的難點(diǎn)在于如何直觀、定量地測量病毒在植物樣品上的分布與積累。FluorCam熒光成像技術(shù)的出現(xiàn)解決了這一難題。法國國家農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院利用FluorCam封閉式熒光成像系統(tǒng)，從2015年起發(fā)表了一系列相關(guān)文章，研究方向包括病毒的TOR信號調(diào)控、跨物種合成eIF4E1等位基因獲得病毒抗性、利用CRISPR-Cas9 base editing基因編輯技術(shù)模仿eIF4E自然多態(tài)性與病毒抗性的關(guān)系、擬南芥敲除eIF4E1獲得ClYVV抗性但又與TuMV的敏感性相關(guān)等。這些研究中，FluorCam熒光成像技術(shù)提供了關(guān)鍵的GFP活體成像圖，定量分析感染面積與病毒積累量，從而直觀地反映了不同基因功能對擬南芥病毒抗性的影響。同時，葉綠素?zé)晒獬上駝t反映病毒對光合系統(tǒng)的損傷，可以同步提供植物的光合表型信息。
美國田納西大學(xué)、突尼斯El Manar大學(xué)、法國艾克斯-馬賽大學(xué)等科研機(jī)構(gòu)也同樣使用FluorCam熒光成像技術(shù)的RFP、GFP活體成像功能進(jìn)行了TuMV、黃單孢菌屬等致病菌的調(diào)控機(jī)理研究。
參考文獻(xiàn)：
- Zafirov D, et al. 2021. When a knockout is an Achilles' heel: Resistance to one potyvirus species triggers hypersusceptibility to another one in Arabidopsis thaliana. Mol Plant Pathol. 22: 334–347
- Bastet A, et al. 2019. Mimicking natural polymorphism in eIF4E by CRISPR‐Cas9 base editing is associated with resistance to potyviruses. Plant Biotechnology Journal 17: 1736–1750
- Bastet A, et al. 2018. Trans-species synthetic gene design allows resistance pyramiding and broad-spectrum engineering of virus resistance in plants. Plant Biotechnology Journal: 1–13
- Ouibrahim L, et al. 2015. Potyviruses differ in their requirement for TOR signaling. Journal of General Virology 96, 2898-2903
- Liu W. et al. 2014. Synthetic TAL effectors for targeted enhancement of transgene expression in plants. Plant Biotechnology Journal 12, 436–446
- Abdelkefi H, et al. 2018. Guanosine tetraphosphate modulates salicylic acid signalling and the resistance of Arabidopsis thaliana to Turnip mosaic virus. Molecular Plant Pathology 19(3): 634-646
文獻(xiàn)案例二：珊瑚共生體的生態(tài)功能研究
珊瑚是腔腸動物珊瑚蟲與蟲黃藻組成的共生體。葡萄牙阿威羅大學(xué)與美國喬治亞大學(xué)合作研究珊瑚共生體的葉綠素?zé)晒獬上?mdash;—反映光合能力，NDVI反射光譜指數(shù)成像——反映葉綠素的分布及濃度變化，GFPs（綠色熒光蛋白類似蛋白）成像——珊瑚蟲本身具備的蛋白，但其意義尚不明確。目前只有FluorCam熒光成像技術(shù)可以同步進(jìn)行這三種成像分析。研究結(jié)果不但再次證實(shí)了珊瑚本身具備*的光合作用能力，而且發(fā)現(xiàn)葉綠素和GFPs的分布會隨著珊瑚蟲的膨脹收縮而同步變化，同時兩者間表現(xiàn)出顯著的分布差異。葉綠素濃度（NDVI）在珊瑚口盤處減少，而GFPs則增加。而葉綠素?zé)晒鈪?shù)最大光化學(xué)效率Fv/Fm的分布則沒有與葉綠素濃度和GFPs的分布表現(xiàn)出相關(guān)性。
參考文獻(xiàn)：
Leal MC, et al. 2015. Concurrent imaging of chlorophyll ?uorescence, Chlorophyll a content and green ?uorescent proteins-like proteins of symbiotic cnidarians. Marine Ecology, DOI: 10.1111/maec.12164
文獻(xiàn)案例三：植物內(nèi)生細(xì)菌開發(fā)
很多植物內(nèi)生細(xì)菌（plant growth-promoting endophytic bacteria，PGPEB）對植物的生長都具有促進(jìn)作用，但如何有效利用內(nèi)生細(xì)菌，乃至將其開發(fā)成一種新型肥料，就必須探索出一整套制劑配方策略。哥倫比亞農(nóng)業(yè)研究公司與德國比勒菲爾德應(yīng)用科學(xué)大學(xué)、萊布尼茨蔬菜和觀賞作物研究所（IGZ）合作，開發(fā)一種植物生長促進(jìn)內(nèi)生細(xì)菌Kosakonia radicincitans DSM16656的制劑配方策略。這種內(nèi)生細(xì)菌可以通過蘿卜根系形成內(nèi)生后，會顯著促進(jìn)蘿卜的生長。為了能夠直觀檢測不同配方處理后細(xì)菌在蘿卜根系的活力，研究者直接將不同處理后帶GFP標(biāo)記的細(xì)菌液滴與蘿卜根系放置到FluorCam開放式熒光成像系統(tǒng)中，進(jìn)行GFP成像成像分析。從GFP熒光強(qiáng)度上即可直接反映不同處理后內(nèi)生細(xì)菌的活性，從而優(yōu)化最佳的制劑配方策略。
參考文獻(xiàn)：
Barrera MC, et al. 2020. Formulating bacterial endophyte: Pre-conditioning of cells and the encapsulation in amidated pectin beads. Biotechnology Reports 26: e0046
北京易科泰生態(tài)技術(shù)公司提供植物活體成像研究全面技術(shù)方案：
- FluorCam葉綠素?zé)晒饧盁晒獾鞍谆铙w成像系統(tǒng)
- FluorCam多光譜熒光成像系統(tǒng)
- Thermo-RGB紅外熱成像技術(shù)
- Specim高光譜成像測量技術(shù)
- PhenoPlot輕便型作物植物表型成像分析系統(tǒng)
- PhenoTron®-HF植物表型與種質(zhì)成像分析平臺
- PlantScreen植物高通量表型成像分析平臺
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